科普：ELISA試劑盒技術(shù)基礎(chǔ)知識
一、酶免疫技術(shù)的分類
酶免疫技術(shù)是以酶標(biāo)記的抗體或抗原為主要試劑的方法，是標(biāo)記免疫技術(shù)的一種。免疫技術(shù)是利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行的檢測方法，即應(yīng)用制備好的特異性抗原或抗體作為試劑，以檢測標(biāo)本中的相應(yīng)抗體或抗原。它的特點(diǎn)是具有高度的特異性和敏感性。ELISA試劑盒如將抗原或抗體用可以微量檢測的標(biāo)記物（例如放射性核素、熒光素、酶等）進(jìn)行標(biāo)記，則在與標(biāo)本中的相應(yīng)抗體或抗原反應(yīng)后，可以不必測定抗原抗體復(fù)合物本身，而測定復(fù)合物中的標(biāo)記物，通過標(biāo)記物的放大作用，進(jìn)一步提高了免疫技術(shù)的敏感性。這種標(biāo)記免疫技術(shù)一般分為兩類，一類用于組織切片或其他標(biāo)本中抗原或抗體的定位；另一類用于液體標(biāo)本中抗原或抗體的測定。前者屬于免疫組化技術(shù)范疇，后者則稱為免疫測定。
酶免疫測定根據(jù)抗原抗體反應(yīng)后是否需要分離結(jié)合的與游離的酶標(biāo)記物而分為均相和異相兩種類型，實(shí)際上所有的標(biāo)記免疫測定均可分成這兩類。以標(biāo)記抗體檢測標(biāo)本中的抗原為例，按照簡單的形式是在試劑抗體過量的情況下進(jìn)行，其反應(yīng)式如下：
Ab*+ Ag——Ab*Ag+Ab*
Ab*Ag代表結(jié)合的標(biāo)記物， Ab*為游離的標(biāo)記物。如在抗原反應(yīng)后，先把Ab*Ag與Ab* 分離；然后測定Ab*Ag或Ab*中的標(biāo)記物的量，從而推算出標(biāo)本中的抗原量，這種方法稱為異相法。如在抗原抗體反應(yīng)后Ab*Ag中的標(biāo)記物* 失去其特性，例如酶失去其活力，熒光物質(zhì)不顯熒光，則不需要進(jìn)行Ab*Ag 與Ab*的分離，可以直接測定游離的Ab* 量，從而推算出標(biāo)本中的Ag含量，這種方法稱為均相法。
在異相法中，抗原和抗體如在液體中反應(yīng)，分離游離和結(jié)合的標(biāo)記物的方法有許多種。與放射免疫測定相類似的液相異相酶免疫技測定，在某些激素等定量測定中也有應(yīng)用。但常用的酶免疫測定法為固相酶免疫測定。其特點(diǎn)是將抗原或抗體制成固相制劑，這樣在與標(biāo)本中抗體或抗原反應(yīng)后，只需經(jīng)過固相的洗滌，就可以達(dá)到抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)的分離，大大簡化了操作步驟。這種被稱為EL1SA 的檢測技術(shù)成為目前臨床檢驗(yàn)中應(yīng)用較廣的免疫測定方法。
二、方法類型和操作步驟
ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有3種必要的試劑：① 固相的抗原或抗體，② 酶標(biāo)記的抗原或抗體，③ 酶作用的底物，根據(jù)試劑的來源和標(biāo)本的性狀以及檢測的條件，可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測方法。
（一）雙抗體夾心法：
雙抗體夾心法是檢測抗原zui常用的方法，ELISA試劑盒操作步驟如下：
（1）將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。
（2）加受檢標(biāo)本：使之與固相抗體接觸反應(yīng)一段時(shí)間，讓標(biāo)本中的抗原與同相載體上的抗體結(jié)合，形成固相抗原復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)。
（3）加酶標(biāo)抗體：使同相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。*洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量正相關(guān)。
（4）加底物：酶催化底物成為有色產(chǎn)物。根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量。
根據(jù)同樣原理，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標(biāo)抗原結(jié)合物，即可雙抗原夾心法測定標(biāo)本中的抗體。
（二）雙位點(diǎn)一步法：
在雙抗體夾心法測定抗原時(shí)，如應(yīng)用針對抗原分子上兩個(gè)不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標(biāo)抗體，則在測定時(shí)可使標(biāo)本的加入和酶標(biāo)抗體的加入兩步并作一步。這種雙位點(diǎn)一步法不但簡化了操作，縮短了反應(yīng)時(shí)間，如果使用高親和力的單克隆抗體，測定的敏感性和特異性也顯著提高。單克隆抗體的應(yīng)用使測定抗原的ELISA提高到新水平。
在一步法測定中，應(yīng)注意鉤狀效應(yīng)，類同于沉淀反應(yīng)中抗原過剩的后滯現(xiàn)象。當(dāng)標(biāo)本中待測抗原濃度相當(dāng)高時(shí)，過量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合，而不再形成夾心復(fù)合物，所得結(jié)果將低于實(shí)際含量。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時(shí)甚至可出現(xiàn)假陰性結(jié)果。
（三）間接法測抗體 ：
間接法是檢測抗體時(shí)zui常用的方法，其原理為利用酶標(biāo)記的抗-抗體檢測已與固相結(jié)合的受檢抗體。故稱為間接法。操作步驟如下：
（1）將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原。洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。
（2）加稀釋的受檢血清：其中的特異抗體與抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。經(jīng)洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體。其他免疫球蛋白及血清中的雜質(zhì)由于不能與固相抗原結(jié)合，在洗滌過程中被洗去。
（3）加酶標(biāo)抗抗體：與固相復(fù)合物中的抗體結(jié)合，從而使該抗體間接地標(biāo)記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。例如： 欲測人對某種疾病的抗體，可用酶標(biāo)羊抗人lgG抗體。
（4）加底物顯色：顏色深度代表標(biāo)本中受檢抗體的量。本法只要更換不同的固相抗原，可以用一種酶標(biāo)抗抗體檢測各種與抗原相應(yīng)的抗體。
（四）競爭法：
競爭法可用于測定抗原，也可用于測定抗體。以測定抗原為例，受檢抗原和酶標(biāo)抗原競爭與同相抗體結(jié)合，因此結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原量與受檢抗原的量呈反比。操作步驟如下：
（1）將特異抗體與固相載體連接，形成固相抗體，洗滌。
（2）待測管中加受檢標(biāo)本和一定量酶標(biāo)抗原的混合溶液，使之與固相抗體反應(yīng)。如受檢標(biāo)本中無抗原，則酶標(biāo)抗原能順利地與固相抗體結(jié)合。如受檢標(biāo)本中含有抗原，則與酶標(biāo)抗原以同樣的機(jī)會(huì)與固相抗體結(jié)合，競爭性地占去了酶標(biāo)抗原與固相載體結(jié)合的機(jī)會(huì)，使酶標(biāo)抗原與固相載體的結(jié)合量減少。參考管中只加酶標(biāo)抗原，保溫后，酶標(biāo)抗原與同相抗體的結(jié)合可達(dá)zui充分的量。洗滌。
（3）加底物顯色：參考管中由于結(jié)合的酶標(biāo)抗原zui多，故顏色zui深，參考管顏色深度與待測管顏色深度之差，代表受檢標(biāo)本抗原的量。待測管顏色越淡，表于標(biāo)本中抗原含量越多。
（五）捕獲法測lgM抗體
血清中針對某些抗原的特異性lgM常和特異性lgG伺時(shí)存在，后者會(huì)干擾lgM抗體的測定。因此測定lgM抗體多用捕獲法。先將所有血清lgM（包括異性lgM和非特異性lgM）固定在固相上，在除去lgG后再測定特異性lgM。
操作步驟如下：
（1）將抗人lgM抗體連接在固相載體上，形成固相抗人lgM。
（2）加入稀釋的血清標(biāo)本：保溫反應(yīng)后血清中的lgM 抗體被固相抗體捕獲。洗滌除去其他免疫球蛋白和血清中的雜質(zhì)成分。
（3）加入特異性抗原試劑：它只與固相上的特異性lgM 結(jié)合。
（4）加入針對特異性的酶標(biāo)抗體，使之與結(jié)合在固相上的抗原反應(yīng)結(jié)合。
（5）加底物顯色：如有顏色顯示，則表示血清標(biāo)本中的特異性lgM抗體存在，為陽性反應(yīng)。
（六）親和素和生物素的ELlSA親和素是一種糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每個(gè)分子由4個(gè)亞基組成，可以和4 個(gè)生物素分子親密結(jié)合?，F(xiàn)在使用更多的是從鏈霉菌中提取的鏈霉和素（strepavidin）。生物素（biotin）又稱維生素H，分子量244.31，存在于蛋黃中。用化學(xué)方法制成的衍生物，生物素一羥基玻璃亞胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可與蛋白質(zhì)、糖類和酶等多種類型的大小分子形成生物素化的產(chǎn)物。親和素與生物素的結(jié)合，雖不屬免疫反應(yīng)，但特異性強(qiáng)，親和力大，兩者一經(jīng)結(jié)合就極為穩(wěn)定。由于1個(gè)親和素分子有4個(gè)生物素分子的結(jié)合位置，可以連接更多的生物素化的分子，形成一種類似晶格的復(fù)合體。因此把親和素和生物素與ELIS偶聯(lián)起來，就可大大提高檢測的靈敏度。
親和素——生物素系統(tǒng)在ELISA中的應(yīng)用有多種形式，ELISA試劑盒可用于間接包被，亦可用于終反應(yīng)放大。可以在同相上先預(yù)包被親和素，原用吸附法包被固相的抗體或抗原生物素結(jié)合，通過親和素——生物素反應(yīng)而使生物素化的抗體或抗原固相化，這種包被法不僅可增加吸附的抗體或抗原量，而且使其結(jié)合點(diǎn)充分暴露。另外，在常規(guī)ISA中的酶標(biāo)抗體也可用生物素化的抗體替代，然后連接親和素——酶結(jié)合物，以放大反應(yīng)信號。
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