信帆生物與您分享明膠酶譜試劑盒實(shí)驗(yàn)小竅門(mén)！
基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)以無(wú)活性的酶原形式分泌，活化后能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)的膠原蛋白，又稱膠原酶。通過(guò)影響細(xì)胞外基質(zhì)，膠原酶參與胚胎發(fā)育、形態(tài)發(fā)生、組織重塑等過(guò)程，并參與炎癥、腫瘤、心血管、神經(jīng)等許多疾病過(guò)程。血漿與組織中的MMP-2、MMP-9參與各種生理與病理過(guò)程，其在診斷和治療中的意義日益受到重視。
檢測(cè)原理
本試劑盒采用酶譜法(Zymography)檢測(cè)MMP-2、MMP-9 活性。Zymography 是一種廣為使用的、基于SDS-PAGE 電泳和反相凝膠染色的蛋白酶檢測(cè)方法，其靈敏度可達(dá)1 nM，高于ELISA方法，其基本原理和程序是：制備加有膠原酶底物的SDS-PAGE 凝膠，含蛋白酶的樣品在此凝膠中進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后取出凝膠與酶反應(yīng)Buffer 孵育，凝膠染色與脫色。凝膠中由于含底物蛋白而被深染，形成深色背景，但在有蛋白酶條帶的位置，蛋白酶將降解凝膠中的底物蛋白，因而不被染色而形成透亮區(qū)域，從而能同時(shí)指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性。本試劑盒提供MMP-2、MMP-9 特異蛋白底物及酶學(xué)反應(yīng)緩沖液，可檢測(cè)少至0.1~0.5μl 血液中的MMP-2、MMP-9 酶譜及活性，檢測(cè)靈敏度~1nM。試劑盒可進(jìn)行50次標(biāo)準(zhǔn)小膠檢測(cè)，如果小膠加樣孔為10~15個(gè)，則總計(jì)可檢測(cè)500~750個(gè)樣品。
實(shí)驗(yàn)中的小貼士告訴大家：
1.做酶譜要測(cè)定樣品蛋白的濃度（同Western blot，建議用BCA法）；
2.酶譜法是測(cè)定樣品中MMP-2、9活性的，如果煮沸使蛋白變性就沒(méi)有用了，故禁忌煮沸；
3.上樣緩沖液中也不能加β-巰基乙醇，這點(diǎn)由western blot轉(zhuǎn)作明膠酶譜的朋友切記、切記；
4.蛋白上樣量必須保證一樣，不會(huì)出現(xiàn)一致的透明條帶，如果不能保證上樣量一致，測(cè)出的相對(duì)活性也沒(méi)有統(tǒng)計(jì)分析的意義；
5.上樣時(shí)zui重要的一點(diǎn)，必須在4℃環(huán)境中操作，我用的是冰臺(tái)，同時(shí)所用的蛋白樣品（-80℃冰箱）不能是以前曾解凍使用過(guò)的，必須是新取出的，因?yàn)橹灰鈨鼍蜁?huì)有部分酶降解，影響你的結(jié)果。此外做過(guò)一次酶譜的蛋白樣品也不要反復(fù)使用，下次應(yīng)使用其它已分裝、未解凍過(guò)的樣品；
6.電泳后的步驟很簡(jiǎn)單，液體別配錯(cuò)，照著方法做就可以了。
如果你曾做過(guò)Western blot，在這里恭喜你了，只要注意幾個(gè)小細(xì)節(jié)，明膠酶譜對(duì)你非常簡(jiǎn)單。
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